食品微生物检验细菌的革兰氏染色实训

1. 实验器材

普通光学显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、镊子、酒精灯等。

2. 实验试剂

蒸馏水、生理盐水、草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄染液。

3. 实验材料

枯草芽孢杆菌斜面、金黄色葡萄球菌斜面、大肠杆菌斜面。

4. 操作程序

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→95%乙醇脱色20～30s→水洗

→番红复染1-2min→水洗→干燥→镜检观察。

图1-1 革兰氏染色过程简略示意图

1. 方法与步骤

（1）涂片

取一块载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别平板中挑取少量可疑菌落于水滴中，混匀并涂成薄膜。

（2）干燥

室温自然干燥。

（3）固定

固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，

以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

（4）初染

加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。

（5）媒染

滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

（6）脱色

将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不

出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

（7）复染

用番红液染1～2min，水洗。

（8）镜检

干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

2. 结果与报告

根据观察结果绘出枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等的形态图，注明放大倍数、及观察到的颜色。

3. 注意事项

（1）载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片时生理盐水不宜过多；涂片必须薄而且均匀。

（2）热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

（3）革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。

（4）镜检时，以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（5）染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物紫形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时需要注意。