食品微生物微生物培养基制作技术实训

1. 实验器材

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、锥形瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管桶、培养皿及培养皿桶、玻璃棒、烧杯、试管架、剪刀、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

2. 实验试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、马铃薯、豆芽汁、磷酸铵、K2HPO4、NaNO3、KCL、MgSO4、FeSO4、1 mol/L NaOH溶液、 1 mol/L HCL溶液等。

3. 实验流程

选择原料→计算→称重→混合溶解→调整pH→（加指示剂）→溶化琼脂→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→鉴定→保存。

4. 实验步骤

1) 原料的选择、计算与称量：根据培养基的配方，计算所配培养基需要原料的准确数量，选择不同精密的称量工具进行原料的称取，常见的称量工具有托盘天平、电子天平、分析天平等。 一般情况下，原料的称量不需要很高精密度的仪器，用电子天平就可以了。

2) 混合溶解：将称量好的各种原料根据要求将先后放入烧杯或其它容器中进行混合溶解，注意先加少于总量的水，在电炉上加热溶解，溶解时需不断搅拌。固体培养基需要最后加入琼脂，边加边搅拌，待完全溶解后，补足所失水分。

3) 调整pH 值：用pH 试纸或 pH 计测定培养基 的pH，常用1moL/L NaOH溶液 或 1 moL/L HCL溶液调节培养基的 pH 到所需范围。注意等培养基稍降低一些温度后进行调节培养基pH值；在调节pH时，要逐滴加入酸碱调节剂，并随时测定，以免调过再回调，否则会增加培养基中的钠、氯等离子的含量。

4) 加指示剂：对某些培养基，按要求加入一定量指示剂。这时也需要注意培养基温度不要太高。也可以将指示剂单独灭菌，在用前，按需要比例加入溶解后的培养基，摇匀备用。

5) 溶化琼脂：固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全熔化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

6) 过滤：培养基配制后一般都有沉渣或浑浊出现，需要过滤方可使用，可用滤纸或2～4层的纱布过滤。固体培养基最好趁热用纱布过滤。

7) 分装：将过滤后的培养基根据实验需要分装于不同容器内，注意各容器的分装量要求。三角烧瓶：不超过容量的1/2 ，高度的1/3 。试管：液体培养基、半固体培养基约装试管容量的1/4 ～ 1/3 ；斜面培养基约装试管容量的1/5 。

8) 加塞：由纱布包棉花做成的棉塞（形如未打开伞之幼嫩蘑菇，大小和松紧适中）和现在的硅胶塞。因为硅胶塞一般不透气，在灭菌的升温和降温过程中，试管内外压力会有差异，当管内压力大于管外压力时可能使塞子飞出或试管爆裂。为了之后的灭菌过程顺利，我们一般选用棉花塞。棉花塞透气，能保持内外压平衡，同时又能阻止细菌进入。棉花塞制作方法参见图3-1。

①棉塞制作方法一

②棉塞制作方法二

图3-1 棉塞制作方法（两种方法）

培养基分装后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，如培养基在短期内使用，也可在试管口套上试管帽。棉塞的作用有：一是阻止外界微生物进入培养基内，防止引起培养基的污染。二是保证培养时有良好的通气性能，因此棉塞的好坏对实验的结果将有所影响。棉塞一般不宜用脱脂棉做，因为它易吸水变湿，容易造成污染，加塞时，棉塞总长的 2/3 在口内，1/3 在口外。

9) 包扎标记：加好塞后，在棉塞外再包上一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水直接沾湿棉塞及存放中防止尘埃等污染。若培养基分装于试管中，则应先将试管成捆扎牢，上面包一层牛皮纸再扎紧，然后贴上标签，标明培养基名称、日期及组号后进行灭菌。

10) 灭菌：最常用的是高压蒸汽灭菌法，将待灭菌的培养基放入加压灭菌锅内，培养基灭菌时的温度和灭菌时间，按照不同种类的培养基的规定进行操作。以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。

一般培养基配制说明上推荐的灭菌时间，是假定所灭菌的培养基的体积为1L或1L以下。如果需灭菌培养基的体积增加，时间延长，温度不变。含有碳水化合物的培养基在高压蒸汽灭菌时，温度不能超过116℃～l18℃，防止出现碳水化合物的碳化水解。需要注意过度灭菌的培养基可能出现以下问题：培养基碳化或变黑；出现非典型的沉淀；降低琼脂的凝结能力；改变正确的pH；失去营养价值；失去选择性或鉴别性的能力。

高压蒸汽灭菌锅操作步骤如下：①加水：先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜注意水量一定要加足，否则容易造成事故。

②装料：放回内层灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而打湿棉塞。

③加盖密封：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，切勿漏气，否则达不到彻底灭菌的目的。

④排气升压：接通电源进行加热，并同时打开排气阙，使水沸腾以排出锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后(约1Omin)，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制电源，维持压力至所需时间。

⑤降压：达到规定的灭菌时间后，切断电源，让其自然降压冷却。

⑥取料：待压力完全降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品。如果压力未降到“0”时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口或试管，造成棉塞沾污培养基而易发生污染。

⑦倒水：灭菌锅使用过后，需将锅内剩余的水倒掉，使锅内保持干燥，以免日久腐蚀，并做好各项安全检查后方能离开。

将上述培养基以0.105MPa，20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌则应放入冰箱内保存，但切记时间不宜过久。

拿出培养基后，按实验需要进行制作斜面、平板等。若需制成斜面，则试管应倾斜放置，冷却后即制成（参见图3-2）；做穿刺用的固体或半固体培养基，试管应直立放置；制作成平板的，每个培养皿倒入15～20mL ，倒入后可以在平整的实验台面上顺时针或逆时针摇匀，摇匀时注意不要将里面的培养基溅出（参见图3-3）。

图 3-2 斜面培养基的制作 

图3-3 将培养基倒入培养皿内

11) 鉴定：将消毒冷却后的培养基置于 37 ℃恒温箱内 培养24-48h后观察有无杂菌生长，如无杂菌生长则可接入微生物菌种，经培养后观察微生物生长发育情况，以便确定培养基是否合于实验要求。

12) 保存：经验定合格的培养基，可存放于冰箱（4 ℃左右）内或暗凉处清洁的柜内，避免干燥、氧化、pH 值的改变和杂菌的污染，这样保存数星期仍然可用。但不宜保存时间过久，以少量勤做为宜。

5. 注意事项

（1）称药品用的各种药匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖，瓶盖切莫张冠李戴，尤其是易吸潮的蛋白胨等更应注意及时盖紧瓶塞与旋紧瓶盖。

（2）调pH时要小心操作，尽量避免回调而带入过多的无机离子。

（3）配制半固体或固体培养基时，琼脂的用量应根据市售琼脂的牌号而定，否则培养基的软硬程度也会影响某些实验结果。